Larry Daley is een werkeloze, gescheiden vader en wanhopig op zoek naar een baan. Er lijkt hoop in het verschiet wanneer hij aan de slag kan als nachtwaker in het Museum of Natural History. Op zijn eerste nachtdienst komt hij er echter achter dat dit museum niet is zoals alle andere musea. De museumstukken blijken om middernacht tot leven te komen. De historische volkeren en dieren maken Larry 's nachts het leven zuur. In al deze chaos kan Larry zich maar tot één persoon richten: een wassenbeeld van president Teddy Roosevelt, dat hem moet helpen deze chaos te stoppen.