Larry Daley werkt niet meer als nachtwaker bij het Museum of Natural History sinds zijn bizarre nacht met levende museumstukken. Het museum is inmiddels gesloten wegens renovatiewerkzaamheden en Larry's bijzondere museumvrienden zijn verscheept naar het beroemde Smithsonian Institution. Hun komst daar zorgt ervoor dat een aantal van de al aanwezige stukken ook tot leven komt, waaronder de Egyptische farao Kahmunrah, Ivan de Verschrikkelijke, Napoleon en Al Capone. Dat vijandige viertal is van plan om het museum over te nemen en daarna de wereld te veroveren. Larry's hulp wordt ingeroepen door zijn oude kameraad, miniatuurcowboy Jedediah, om te voorkomen dat deze plannen werkelijkheid worden.