De film draait om gezagvoerder Malcolm Reynolds, een verbitterde veteraan die vocht (aan de verliezende kant) van de onafhankelijkheidsoorlog tegen de interplanetaire machtshebbers, de Alliantie. Tegenwoordig verdienen ze de kost door met hun ruimteschip Serenity vracht en passagiers te vervoeren. Men is ook niet vies van diefstal, liefst van de Alliantie natuurlijk. Echte problemen beginnen als Mal en co. een jonge arts en zijn telepathisch begaafde, maar labiele zus, aan boord neemt. Opgejaagd door deze zeer verschillende vijanden, komt de bemanning langzaam maar zeker tot de ontdekking dat het grootste gevaar zich mogelijk aan boord van Serenity zelf bevindt.